Микроскопия. Фундаментальные знания. (Часть 2)

В первой части мы рассмотрели физические свойства света и его взаимодействие с оптическими поверхностями. Нами были затронуты такие темы, как длина волны, частота и энергия, а также поглощение, рассеивание, преломление, отражение, интерференция, поляризация и дифракция. Во второй части мы более подробно остановимся на том, как та или иная комплектация микроскопа влияет на его возможности.

В состав микроскопа входит множество деталей, например, объектив, окуляр, конденсор и полевые линзы. Знание основных принципов использования этих элементов, поможет вам максимально использовать ваш микроскоп. Однако сначала необходимо понять, какова же базовая комплектация современного светового микроскопа. Объект расположен на предметном столе и освещен либо сверху, либо снизу. Свет, отраженный от объекта, захватывается линзами объективов и проектируется в виде увеличенного изображения через линзы тубуса к диафрагме окуляров, где оно фокусируется на так называемой плоскости промежуточного изображения. Окуляры далее увеличивают это изображение и проектируют его на сетчатке глаза наблюдателя.

Поле зрения окуляров (Field Number — F. N.) и Фактическое поле зрения (Practical Field of view)

Диаметр поля зрения (П. З.) оптического микроскопа выражен полем зрения окуляров (F. N.). Это диаметр видимого поля в миллиметрах, увеличенного на плоскости промежуточного изображения. Определяется он диаметром диафрагмы поля зрения. Размер поля плоскости образца (диаметр части образца в поле зрения), называется полем зрения (П. З.) (Field of view — F. O. V.) и определяется как поле зрения окуляров деленное на увеличение окуляров следующим образом:

 

 

Рабочее расстояние (W. D.) и Парфокальная дистанция

Чтобы увеличить количество света, захватываемого линзами объектива для фронтальной линзы (см. также числовая апертура), необходимо небольшое свободное рабочее пространство. Это расстояние от фронтальной линзы до поверхности препарата, когда он находится в фокусе.
Фронтальные линзы объектива используются также в химической и металлургической микроскопии. Там их поверхность должна быть защищена от окружающих вредных факторов (высокие температуры, химические испарения, летучие вещества), поэтому она закрыта покровным стеклом, из-за чего неизбежно увеличение рабочего расстояния. Для таких целей были созданы специализированные объективы с рабочим расстоянием в 2—3 раза больше, чем у обычных микроскопов, несмотря на последующие затруднения в достижении необходимой числовой апертуры и требующихся настроек для оптической аберрации. Рабочее расстояние меняется для каждого объектива, а парфокальная дистанция для большинства из них утверждена соглашением Королевского Общества Микроскопии (RMS) и равна 45.0 мм. Это расстояние между линзами объективов плоскости опоры и образцом. Это определенная дистанция фокусировки, при которой изменение масштабирования не влияет на фокус. Рис. 2 показывает краткие данные частей современного микроскопа: линз объективов и деталей и рабочее расстояние и парфокальную дистанцию при такой комплектации.

Оптические длины и увеличение объективов

В первых микроскопах длина трубки объектива была ограничена. Эти объективы использовались для фокусирования (и увеличения) картинки на плоскости промежуточного изображения. Современные же микроскопы в основном используют оптическую систему, скорректированную на бесконечность, объективы проектируют изображение на бесконечность, а не фокусирует его. Это выгодно по многим причинам, например, промежуточные компоненты, такие как поляризационные призмы и светоделитель могут быть расположены в луче света без использования дополнительно корректирующей оптики. Высота тубуса определяется как расстояние от начала револьверного устройства (куда вмонтирован объектив) до верхнего края тубуса (куда вмонтированы окуляры). Сила увеличения линз объективов это результат деления фокальной длины тубуса на фокальную длину объективов:

M(ob): увеличение линз объектива (Objective lens magnification)
f: фокальная длина линз объектива

Вычисление общего увеличения

Оптические элементы способствуют общему увеличению изображения, но важно помнить, что на формирование конечного изображения влияет не только увеличение объективов.
Наблюдение через окуляры (бинокулярное):


M(bino): общее увеличение для бинокулярного исследования
M(ob): увеличение линз объективов
M(oc): увеличение окуляров

Исследование на видеомониторе

М(видеомонитор): общее увеличение видеомонитора
M(ob): увеличение линз объективов
М(видеоадаптер камеры): настраиваемое увеличение для адаптера видеокамеры, включая фото окуляры

Рис. 3: А: Устройства формирования изображения

Формат камеры

Цифровая

Горизонтально

Вертикально

1/3"

6.0 мм

4.8 мм

3.6 мм

1/2"

8.0 мм

6.4мм

4.8 мм

2/3"

11.0 мм

8.8 мм

6.6 мм

Рис. 3: В: Устройства формирования изображения и увеличение монитора

Формат камеры

Размер монитора (цифрового)

 

9"

12"

14"

21"

27"

1/3"

38.1х

50.8х

59.2х

84.6х

114.1х

1/2"

28.6х

38.1х

44.5х

63.5х

85.7х

2/3"

20.8х

27.7х

32.3х

46.2х

62.3х

*согласно рис. 3В для «Увеличения монитора», использование видеомониторов для изучения образцов, также изменяет фактическое поле зрения согласно расчетам по формуле, приведенной ниже:

 


 

M(ob): увеличение линз объективов
М(адаптер видеокамеры): настраиваемое увеличение для видеоадаптера камеры, включая фото окуляры

*согласно рис. 3А для размера видео регистратора

Пример


Какое общее увеличение для монитора, если используются линзы объектива — 50х, видеоадаптер камеры — 0,5хС и видеокамера 2/3"?

Общее увеличение видеомонитора:
M(ob) = 50х
М(адаптер видеокамеры) = 0,5х
Увеличение монитора = 46.2х (из табл. 3)

М(видеомонитор)50 × 0.5 × 46.2 = 1155х

Фактическое поле зрения для видео исследования (горизонтальное):
M(ob) = 50х
М(адаптер видеокамеры) = 0,5х Горизонтальное увеличение для видеоадаптера 2/3"=8.8мм

Числовая апертура, яркость и разрешение

Числовая апертура объектива микроскопа — величина, используемая для выражения яркости или разрешающей способности оптической системы объектива. Числовая апертура (N. A.- Numerical Aperture) вычисляется по следующей формуле:


где n — уровень преломления среды между препаратом и линзами объектива, (например, воздух n=1, вода n=1,33, глицерин n=1,47, масло n=1,515).
θ — это угол, показывающий угловую апертуру (максимальное количество света, которое может проходить через линзу).

 

Яркость

Видимая яркость поля (B-brightness) микроскопа определяется по следующей формуле, в соответствии с увеличением линз объективов (M(ob)). Однако яркость будет становиться больше с ростом N. A. и/или когда увеличение объективов будет уменьшаться.

Разрешающая способность

Разрешающая способность линз объективов характеризует их способность давать раздельные изображения двух близко расположенных друг к другу точек. Эта величина прямо пропорциональна апертуре прибора. При небольшой разрешающей способности плавные линии принимают ступенчатую форму.

 

Формула вычисления разрешающей способности

Следующая формула обычно используется для определения разрешающей способности:

 — формула Рэлея

λ — длина волны или излучение (λ=0,55μm используется для видимого света).
N. A. — числовая апертура линз объективов


Пример


100×MPlan Fluorite объектив с N. A.=0.90
λ=0.55μm

 

Глубина резкости микроскопа

Глубина резкости (также называемая глубиной фокусировки микроскопа) — величина, отвечающая за размер четко сфокусированного пространства на изображении. Это число не является универсальным и для каждого человека он будет индивидуален.
В наше время распространено использование формулы Берека для вычисления величины глубины фокусировки, т. к. получаемый результат наиболее близок к имеющемуся значению в сравнении с конечными данными, вычисленными другими подобными формулами.

 

Формула вычисления глубины резкости (D. O. F. — Depth of field formula)

Визуальное наблюдение (формула Берека):

D. O. F. — глубина резкости
ω — разрешающая способность глаз 0.0014 (когда угол пересечения оптических осей равен 0.5 градуса).
М — общее увеличение (увеличение линз объективов х увеличение окуляров).

Из формулы видно, что глубина резкости уменьшается, в то время как числовая апертура увеличивается.

Пример


Объектив 100×MPlan Fluorite с N. A.=0.90 и линзы окуляров 10х

  

Аберрации

Быстрый и легкий способ определения аберрации – расчет разницы между «идеальным» и фактическим изображением, имеющей место в оптической системе.

 

Условия, необходимые для формирования идеального изображения

Рис.  отображает 3 условия, которые должны быть удовлетворены, для достижения формирования изображения без аберрации — идеального изображения.


i. Все лучи света, падают через одну точку, проходят через оптическую систему, формируя изображение, и сходятся в одной точке.
ii. Точки изображения соответствуют точкам объекта в той же плоскости, перпендикулярно оптической оси и находятся в плоскости изображения.
iii. Плоскость объекта и плоскость изображения расположены перпендикулярно относительно оптической оси и идентичны.

Тем не менее, в существующей оптической системе трудно обнаружить выполнение всех 3-х условий для создания идеального изображения и всегда отмечается присутствие одного или нескольких видов аберрации.

 

Классификация аберраций

Примеры аберраций, препятствующих созданию идеального изображения, указаны на рис.5. Они делятся на 3 группы: аберрация Зайделя, хроматическая аберрация и аберрация волнового фронта (здесь не раскрывается).

 

Аберрация Зайделя

В 1857 году был опубликован научный труд выдающегося немецкого математика Филиппа Людвига фон Зайделя, в которой он выделил 5 основных типов аберрации для монохромного света, основанных на трех различных свойствах:
— расширения точек изображения
— искривления поверхности
изображения
— деформации

 

Пять аберраций Зайделя:

Сферическая аберрация

Сферическая аберрация имеет место, когда широкий пучок монохроматического света, исходит из точки, принадлежащей главной оптической оси линзы, и при прохождении через линзу, пересекается не в одной, а в нескольких точках, которые находятся на оптической оси, но по-разному удалены от линзы. Изображение получается нечетким (Рис.5а). Вследствие чего сферические аберрации пропорциональны числовой апертуре (N. A.). Это означает, что линзы объективов с большей числовой апертурой имеют большее разрешение, но наихудшую аберрацию.

Кома аберрация

Несмотря на то, что сферическая аберрация может уменьшаться до абсолютного минимума, есть случаи, когда лучи света выходят из точек вне оптической оси линзы и не концентрируются в одной точке на плоскости изображения, а создают асимметрию. Получается расплывчатое пятно, как показано на рисунке 5b. Такое явление называется Кома аберрацией и может быть устранено или скорректировано.

 

Астигматизм

Сферическая и кома аберрация поддаются устранению. Астигматизм — это случай, когда пучок света из точечного источника на оптической оси проходит через линзу и собирается не в одной точке, а превращается в два взаимно перпендикулярных прямолинейных отрезка, которые расположены на некотором расстоянии друг от друга (Рис. 5с).

 

Кривизна поля изображения

Даже когда свет из каждой точки формирует четкое изображение, точки, в которые они переходят после фокусировки, могут лежать на искривленной поверхности, несмотря на ровную плоскость. Когда присутствует кривизна поля изображения, образ смещен тем больше, чем ближе он краю визуального поля. Однако когда происходит фокусировка центра, края становятся размытыми. Чтобы получить полное изображение, включая четкие края, необходимо корректировать этот вид аберрации.

 

Искажение

Когда нет соответствующей зависимости между плоскостью объекта и плоскостью изображения, имеет место явление искажения. При наличии искажения, квадратное изображение появляется в форме бочки или подушечки для булавок, как показано на рисунке 5d.
Оптическая система микроскопа содержит некоторое искажение. Его наличие приводит к появлению неверных результатов в измерениях поверхности. Когда микроскоп используется для точных измерений, обратите пристальное внимание на присутствие этого вида аберрации и обеспечьте его приборами устранения аберрации.

 

Хроматические аберрации

Стекла, используемые для оптических систем микроскопов, имеют различные индексы преломления, зависящие от длины волны. Вот почему различия между фокальными длинами волн образуют смещение плоскости при формировании изображения. Это явление носит название хроматической аберрации, которая иногда встречается как разделение оптической оси и называется осевой хроматической аберрацией (или поперечной хроматической аберрацией), а смещение плоскости изображения называется «хроматической аберрацией величин».
В микроскопии применяется специальное стекло, например, для апохроматии и флюорита, чтобы устранить хроматическую аберрацию в широком спектре (от ультрафиолета до инфракрасного излучения).